آمونیم پر سولفات ۱۰ درصد
آمونیوم پر سولفات gr 1
آب مقطر دیونیزه ml10
یک گرم آمونیم پرسولفات توزین کرده را به ۱۰ میلی لیتر آب مقطر دیونیزه اضافه می کنیم. پس از حل شدن در آب مقطر محلول را برای مصرف چندین هفته در ۴ درجه سانتیگراد نگهداری می کنیم.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

بافر TBE(5X)
اسید بوریک gr 5/27
Tris gr 54
آب مقطر دیونیزه ml 1000
EDTA 0.5M (pH=8) ml 20
- جهت تهیه ۱۰۰۰ میلی لیتر از TBE(5X)
حدود ۸۰۰ میلی لیتر آب مقطر دیونیزه را داخل ارلن ۱۰۰۰ میلی لیتری ریخته و مواد زیر را در آن حل می کنیم:
۵۴ گرم پودر Tris و ۵/۲۷ گرم پودر اسید بوریک بعد از حل کردن مواد فوق ۲۰ میلی لیتر EDTA 5/0 مولار با ۸pH = به آن اضافه کرده و در نهایت حجم محلول را توسط استوانه مدرج با آب مقطر دیونیزه به ۱۰۰۰ میلی لیتر می رسانیم.
بافرTBE(1X)
۱۰۰ میلی لیتر از بافر TBE(5X) را با آب مقطر به حجم ۵۰۰ می رسانیم.
TEMED
بافر بارگذاری (Loading Dye)
فرمامید ml 10
گزیلن سیانول mg 15
بروموفنل بلو mg 3
EDTA 0.5M (pH =8) ml 20
۳-۷-۵-۳ طرز تهیه ژل اکریل امید ۸ درصد
برای بستن و آماده کردن ژل برای تانک الکتروفورز به دو شیشه وspacer و شانه احتیاج است. شیشه های مخصوص را با الکل به دقت تمیز کرده و می گذاریم خشک شود.
spacer ها را به همین ترتیب تمیز می کنیم. spacer ها را به تعداد سه عدد روی گوشه های شیشه و شیشه دوم را روی شیشه اول قرار می دهیم و شیشه ها را با گیره به هم می بندیم. اندازه شیشه ها برای این کار متفاوت است. ژل تهیه شده هم از نظر مقدار تغییر می کند لذا میزان محلول تهیه شده هم متفاوت است.
برای تهیه ژل ۸ درصد مواد زیر را با یکدیگر مخلوط می کنیم:
آب مقطر ml 16
TBE(5X) ml 6
محلول پلی اکریل آمید ml 8
سپس ۳۵۰ میکرو لیتر آمونیم پرسولفات را به آن ها اضافه کرده و مخلوط می کنیم حال به میزان حدوداً ۲ میلی لیتر از محلول را بر داشته و ۱۰ میکرولیتر TEMED به آن اضافه می کنیم و آن را درون فضای بین دو شیشه ریخته کمی در جهت افقی تکان می دهیم تا عمل پر کردن فضاهای بین spacer ها را برای جلوگیری از نشت ژل انجام دهیم.
پس از چند دقیقه بقیه محلول را با ۲۵ میکرولیتر TEMED مخلوط کرده و در درون فضای بین دو شیشه می ریزیم. حال شانه ای تمیز(مخصوص تشکیل چاهک های یک اندازه) را طوری بین فضای بین دو شیشه جای می دهیم که حباب هوا تشکیل نشود. پس از حدود ۳۰ دقیقه ژل پلی مریزه می شود.
گیره های قسمت های مختلف را باز و spacer پایین را به دقت جدا کرده و سپس شانه را با دقت کشیده و از قسمت بالا جدا می کنیم تا چاهک های سالم به دست آید.
قسمت پایین تانک را با بافر TBE (1X) پر می کنیم و شیشه های حاوی ژل را طوری وارد تانک می کنیم تا زیر آن حباب هوا تشکیل نشود. حال شیشه ها را با گیره به تانک می بندیم و قسمت بالای تانک را با بافر TBE(1X) پر می کنیم تا چاهک ها از بافر پر شوند.
قبل از لود کردن محصول PCR باید چاهک های ژل را با بافر بالای تانک شست تا هیچ ژلی داخل آن نمانده باشد.
مقدار ۱ تا ۲ میکرولیتر از بافر بارگذاری را با ۲ میکرولیتر از محصول PCR خود به وسیله سمپلر^[۶۲] مخلوط کرده و در درون چاهک می ریزیم.
الکترودها را وصل می کنیم. بسته به اندازه محصول های مختلف PCR با ولتاژ و زمان خاص هر مارکر ژل را Run می کنیم. سپس شیشه ها را جدا کرده و ژل را رنگ آمیزی می کنیم.
۳-۷-۵-۴ رنگ آمیزی ژل به روش نیترات نقره
برای رنگ آمیزی ژل می توانیم از اتیدیوم بروماید استفاده کنیم، ولی رنگ آمیزی نقره کم خطرتر است و حساسیت بالاتری نسبت به اتیدیوم بروماید دارد. جهت رنگ آمیزی نقره که برای رنگ کردن ژل پلی اکریل امید استفاده می شود نیاز به سه محلول داریم.
۳-۳-۷-۵-۴-۱ مواد لازم جهت رنگ آمیزی نقره
محلول A
اتانول ۹۶% ml 50
اسید اسیتیک ml 2
حجم محلول رابا آب مقطر دیونیزه به ۵۰۰ میلی لیتر می رسانیم.
محلول B
یک گرم نیترات نقره را در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر دیونیزه حل می کنیم که محلول ۱ درصد به دست می آید. حال باید محلول ذخیره را ۱۰ برابر رقیق کرد (۲۵ میلی لیتر از محلول ۱ درصد را با آب مقطر به حجم ۲۵۰ میلی لیتر می رسانیم ).
محلول C
۱۰ میلی لیتر از محلول ۵/۳۷% سود را با آب مقطر دیونیزه به حجم نزدیک ۲۵۰ میلی لیتر می رسانیم. سپس ۱۰-۵ دقیقه مانده به مرحله آخر رنگ آمیزی، ۱ میلی لیتر فرمالدئید به محلول اضافه می کنیم.
۳-۷-۵-۴-۲ روش رنگ آمیزی نیترات نقره