آنزیمهای باند شده به غشاء غیر فعال می شوند. که منجر به تغییر ساختار و مرگ سلول می شود

Sondi and Sapek-sondi., 2004

باز داشتن آنزیمهای تنفسی، تسریع کردن تولید گونه های اکسیژن و تخریب و مرگ سلول

Pal et al., 2007

مکانیسم های مولکولی: یونهای نقره افزایش یافته (حتی در غلظتهای پایین) می توانند به غشاء سلولی نفوذ کنند چون پروتئین های دواره ی سلولی را تخریب می کنند و یکباره در سلول باعث از بین رفتن انرژی و مرگ سلول می شود.

Dibrov et al., 2002

جدول ۲-۱: نمونه هایی از مکانیسم های پیشنهادی سمیت(نانو)نقره

تعدادی از محققان نشان داده اند که ذرات نانو نقره می تواند توانایی تکثیر DNA را در باکتریها تخریب کند و یا به DNA آسیب رساند (Berger., 2007). Ahamed et al., 2008 از ۲ لاین سلولهای جنینی پستانداران^[۱۹] برای بررسی اثر نانو ذرات نقره پوشش دار و بدون پوشش (nm 25) روی DNA استفاده کردند. هر دو نوع این نانو ذرات باعث مرگ سلول و آسیب دیدن DNA شد.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۱-۱۰ سمیت نانو نقره ممکن است به اندازه و شکل آنها وابسته باشد
نانو ذرات نقره به طور معمول از nm 50-1 استفاده می شوند. نانو ذرات نقره ای که کوچکتر از nm 10 هستند می توانند به دیواره سلولی نفوذ کنند (Morones etal., 2005). تعدادی از محققان نشان داده اند که اندازه های متفاوت نانو ذرات نقره اثرات سمیتی متفاوتی را نشان می دهند .(Carlson et al., 2008 , Morones et al., 2005, Elechigverra et al., 2005) برای مثال Elechiguerra et al., 2005 نشان داد که واکنش ویروس HIV-I با نانو ذرات نقره به شدت به اندازه ی نانو ذرات وابسته است. نانو ذرات نقره در طیفی بین nm 10-1 به شدت به ویروس می چسبند و در نتیجه از باندن شدن آن با سلولهای میزبان جلوگیری می کنند.
Sondi and Salopek-Sondi (2004) از مطالعه روی باکتری E.coli دریافتند که نانو نقره به دیواره های سلولی باکتریها آسیب می رسانند و آنها را چاله دار^[۲۰] می کنند و در دیواره ی سلولی جمع می شوند که این حالت منجر به افزایش نفوذ پذیری سلول و در نهایت باعث مرگ سلول می شود.
Pal et al., (2007) پیشنهاد دادند که شاید این اثر نانو نقره در اندازه های کوچکتر به دلیل افزایش سطح موثر صاف آنها می باشد.
۱-۱۱ اثر نقره بر جمعیت های میکروبی کلیدی خاک
مطالعات بسیار کمی روی اثرات نانو نقره بر جمعیت باکتریهای میکروبی خاک در شرایط in sito صورت گرفته است اما همین تحقیقات نشان می دهد نقره، حتی در فرم ذرات بزرگ از رشد میکروبها جلوگیری می کند. مخصوصاً برای باکتریهای هتروتروفیک (Ammanifying/nitrogenfixing) و باکتریهای chemolithotropic متعلق به خانواده­ی lithotropic و مصرف کننده مواد معدنی، Ratte (1999) نشان داد که یونهای نقره آنزیمهای مورد نیاز برای تثبیت کننده نیتریت را مهار می کند. نماتد ها به صورت گسترده ای در خاک حضور دارند ونقش حیاتی در چرخه ی غذایی خاک دارند.کاربرد آنها شامل تولیدات اولیه، تجزیه جریان انرژی و چرخه ی غذایی می باشد. فراوانی نماتد اغلب به عنوان یک شاخص مفید برای بررسی آلودگی یک خاک استفاده می شود. Wnag et al., 2009 نشان دادند که چه به صورت نانو و چه به صورت توده ای اثرات سمی بر روی نماتدها نشان می دهد. تحقیقات اخیر پیشنهاد می کند که میکروارگانیم ها و گیاهان شاید قادر به تولید، تغییر شکل و ذخیره نانو ذرات در طول زنجیره ی غذایی باشند. Tran et al., 2005 اثر نانو مواد هنگامیکه در مجاورت گیاه قرار می گیرند هنوز به صورت گسترده ای بررسی نشده است. اما هنگامیکه نانو ذرات آلومینیوم در مقدار بالایی در مجاورت گیاه قرار داده شده از رشد ریشه در پنج گونه ی گیاهی جلوگیری شد (Yang and Watts, 2005). اما هیچ گزارشی در مورد نانو ذرات نقره گزارش نشده است.
مواد آلی خاک به صورت محکمی با نقره باند می شود و سیالیت و حرکت آن را محدود می کند. برای مثال اسیدهای هومیک و فولمیک نشان داده شده است که می توانند تا mg/kg 30 خاک را حفظ کند در صورتی که نقره ای که به صورت فیزیولوژیکی می تواند مورد استفاده قرار گیرد می تواند تا ۵% باشد، در خاکهای آلوده نقره در دسترس ممکن است به اندازه کافی برای میکروبهای خاک سمی باشد. میزان نقره در خاک متفاوت است بسته به آنکه آیا تحت تأثیر آلودگی صنعتی mg/kg 2/2 تا mg/kg 44) باشد یا نه (کمتر از mg/kg 1) (Jacobson et al., 2005) با این حال در یک خاک مشخص این امر همیشه ثابت نیست و هر نوع تغییر در کاربری خاک و شرایط محیطی مثل کودها یا باران غیر فصلی می تواند موجب کاهش pH (زیر ۴) و بنابراین می تواند متابولیزه شدن نقره را افزایش دهد . Jacobson et al., 2005 نشان دادند که مقدار مواد آلی یک فاکتور غالب در جذب نقره است. نقره همچنین یک واکنش قوی با آنیون ها مخصوصاً سولفیدها را نشان می دهد که منجر به تثبیت شدن عمومی نقره در جریانهای ضایعات و آب های سطحی می شود با این حال مطالب کمی در مورد نانو ذرات نقره مخصوصاً در رابطه با تحرک و فعالیت آلگومراتها وجود دارد. یک جنبه ی مهم در این زمینه این است نانو ذرات نقره منبعی برای یونهای نقره هستند که به صورت پیوسته آن ها ا آزاد می کند. در مبحث حفاظت پایدار خاک Hund –Rinke et al., 2008 به این واقعیت اشاره کردند که دفع ترکیبات پایدار مثل نقره باید کنترل شده باشد از آنجائی که آنها تجزیه نمی شوند اما تجمع می یابند. شرایط محیط زیستی در حال تغییر ممکن است منجر به نتایج نامطلوب شود و یا اثرات جدی ممکن است زمانی که دانش کافی بدست آید شناسایی شود.
۱-۱۲ اهداف تحقیق
با توجه به اهمیت جداسازی پروتوپلاست و کاربرد آن در زمینه های مختلف بیوتکنولو‍‍ژی، ایجاد شرایط مناسب برای بهبود جداسازی و قدرت زیست پروتوپلاست ، از اهمیت ویژه ای برخوردار است. اهداف این تحقیق عبارتند از:

• بررسی تاثیر نانو نقره بر فاکتورهای رویشی گیاه سیب زمینی.

• بررسی تاثیر نانو نقره بر جداسازی و قدرت زیست پروتوپلاست گیاه سیب زمینی.

فصل دوم
مواد و روش ها
۲-۱ مواد گیاهی و شرایط کشت آنها
در این تحقیق از گیاهان سیب زمینی (Solanum tuberosum L.) رقم وایت دزیرهWhite Desiree که در آزمایشگاه تحقیقاتی کشت بافت گروه زیست شناسی دانشگاه اصفهان کشت گردیده بود، استفاده شد.
۲-۱-۱ تهیه ی محیط کشت پایهMS
جهت تهیه ی محیط کشت (Murashing and Skoog, 1962) MS مطابق جدول پیوست ۳، در ابتدا محلول های چهار استوک مورد نظر ( استوک های ۱، ۲، ۳و ۴ ) که به ترتیب دارای عناصر ماکرو(پر مصرف)، عناصر میکرو(کم مصرف)، آهن و دیگر مواد آلی مانند ویتامین ها و… به غیر از ساکاروز هستند، درون آب مقطر حل و آماده گردیدند( این محلول ها در صورت عدم آلودگی می توان در ۴ درجه سانتی گراد نگه داری نمود). با توجه به غلظت هر یک از استوک ها، حجم مورد نیاز از هر استوک برداشته شد و در حجم معینی از آب مقطر ریخته و سپس ۳۰ گرم ساکاروز به آن افزوده شد و پس از حل شدن ساکاروز، حجم محلول به کمک آب مقطر به ۱۰۰۰ میلی لیتر رسانده شد، pH محلول به دست آمده با HCl و NaOH یک نرمال در حد ۹/۵- ۷/۵ تنظیم و پس از آن مقدار ۱۰ گرم آگار به آن افزوده شد. محلول حاضر درون ماکروفر قرار داده شدتا آگار ذوب گردد. در نهایت ۴۰ میلی لیتر از محیط کشت مذاب به دست آمده درون شیشه های ۲۵۰ میلی لیتری کشت بافت گیاهی ریخته شد و به منظور استریل و ضد عفونی شدن در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد و فشار ۲/۱ اتمسفر به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو گردید. محیط های کشت پس از سرد شدن کامل جهت تکثیر گیاهان مورد استفاده قرار گرفت.
۲-۱-۲ آماده سازی محلول نانو نقره
غلظت ها ی مورد استفاده نانو نقره در این مطالعه ۰(شاهد)، ۵/۰،۱، ۵/۱ و ۲ ppm (میلی گرم در لیتر) بود.
نانو نقره به صورت محلول از شرکت Antimicrobial products NANOCID COLOID NANOCID با مشخصات Made in I.R.IRAN و Production Registration No: 118/24974 استفاده شد.
محلول های نانو نقره در غلظت های فوق تهیه و بعد از اتوکلاو کردن محیط کشت پایه و خنک شدن آن تا حدود ۵۰ درجه ی سانتی گراد در زیر لامینار ایرفلور به آن اضافه شد و ظرف حاوی محیط کشت پایه و نانو نقره به خوبی مخلوط گردید. سپس مقدار ۴۰ میلی لیتر در شیشه های مخصوص کشت بافت گیاهی با حجم ۲۵۰ میلی لیتر ریخته شد. محیط های کشت پس از سرد شدن کامل جهت کشت گیاهان مورد استفاده قرار گرفت.
۲-۱-۳ تکثیر گیاهان سیب زمینی
به منظور تکثیر، از گیاهچه های سیب زمینی رشد یافته، بر روی محیط کشت MS و ۴ تیمار نانو نقره استفاده گردید. لذا جوانه های جانبی این گیاهان در شرایط استریل روی محیط کشتMS واکشت گردید، این عمل ۳ الی ۴ مرتبه انجام گرفت و در هر مرحله گیاهچه ها به مدت ۴ هفته روی محیط MS جدید رشد یافتند. سپس از جوانه های جانبی گیاهان رشد یافته بر روی محیط MS جهت تکثیر بر روی محیط های MS(شاهد) و MS حاوی۵/۰، ۱، ۵/۱و ۲ میلی گرم در لیتر نانو نقره به عنوان محیط های تیمار استفاده گردید. شیشه های گیاهچه های مزبور در اتاق کشت و فتوپریود ۱۶ ساعت نور و ۸ ساعت تاریکی و دمای ۲۵ درجه سانتی گراد(۲± ۲۵) قرار گرفتند و پس از گذشت ۵ هفته از زمان تیمار دهی، گیاهچه های سیب زمینی برای بررسی و انجام آنالیز های لازم استفاده شدند.
۲-۲ اندازه گیری فاکتور های رویشی
گیاهچه های سیب زمینی رشد کرده در محیط های شاهد(MS) و حاوی نانو نقره(۵/۰، ۱، ۵/۱ و ۲ میلی گرم در لیتر) بعد از ۵ هفته از محیط کشت جدا و وزن تر آنهااندازه گیری شد.
طول ساقه و ریشه ی گیاهچه های سیب زمینی پس وزن شدن با کمک کاغد های میلیمتری در واحد cm اندازه گیری شد.
تعداد میان گره ها یا به عبارت دیگر تعداد جوانه های جانبی در ساقه شمارش شدند.
اندازه گیری سطح برگ با کمک کاغذ های میلی متری انجام شد به این صورت که تمام برگ ها بدون دمبرگ از ساقه جدا شدند، روی کاغذ میلی متری گذاشته و سطح برگ در واحد mm² گزارش گردید.
گیاهچه های سیب زمینی پس از اندازه گیری وزن تر، طول ساقه، طول ریشه، تعداد میان گره و سطح برگ درون پاکت های کاغذی قرار داده شد و در آون مدل Memmert با دمای ۷۰ درجه ی سانتی گراد به مدت ۴۸ ساعت قرار داده شد. سپس وزن خشک گیاه گزارش گردید.
۲-۳ استخراج و سنجش کلروفیل
مقدار معینی (۱/۰ گرم) ازپهنک رأسی گیاه سیب زمینی رقم وایت دزیره، ۵ هفته از کشت در محیط MS حاوی غلظت های ۰، ۵/۰، ۱، ۵/۱و ۲ میلی گرم در لیتر نانو نقره توزین گردید و سپس با بهره گرفتن از ۵ میلی لیتر استون ۸۰%(پیوست شماره ۴ ) تازه تهیه شده در تاریکی بر روی یخ درون هاون چینی هموژنایز گردید تا در نهایت محلولی همگن و یکدست به دست آمد. سپس عصاره ی حاصل توسط قیف و کاغذ صافی واتمن شماره ۱ درون بالون ژوژه ۱۰ میلی لیتری صاف گردید و حجم محلول به کمک استون ۸۰% به ۱۰ میلی لیتر رسانده شد. به دلیل فرار بودن استون درب بالون ژوژه ها را بسته و دور آن را با پارافیلم کاملاً پوشانده تا از کاهش حجم محلول و تجزیه ی کلروفیل جلوگیری به عمل آید. سپس جذب محلول های به دست آمده به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج های nm663 و nm645 اندازه گیری شد. این عمل برای هر یک از غلظت های نانو نقره سه بار تکرار گردید و سپس میزان کلروفیل طبق فرمول زیر بر حسب mg/gFW محاسبه گردید(Arnon, 1949).
Chlorophyll a= [12.7(D663) – ۲.۶۹(D645) * V/1000W]
Chlorophyll b= [22.9(D645) – ۴.۹۳(D663) * V/1000W]