۳-۲-۲-۵- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

رنگ کوماسی بلو G-250 و R-250
فسفریک اسید و استیک اسید گلاسیال (Merck)
اتانول و متانول مطلق (Merck)
آکریل آمید و بیس آکریل آمید (Merck)
TEMED(N,N,N,N’-tetramethylenediamine)
سدیم دو دسیل سولفات (SDS) (Merck)
آمونیوم پرسولفات (APS)
۲- مرکاپتواتانول
بروموفنول بلو
آلبومین سرم گاو (BSA)
بافر تریس و گلایسین (Merck)
۳-۲-۳- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز
سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (Sigma)
استونیتریل (Merck)
بافر تریس (Merck)
۳-۲-۴- نرم افزارها
نرم افزار Excel 2010(جهت رسم نمودارها)
نرم افزار Sigma Plot (جهت رسم طیف های فلورسانس)
۳-۳- روش­ها
۳-۳-۱- روش تهیه مایعات یونی
۳-۳-۱-۱- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید
در این پژوهش جهت تهیه مایعات یونی از میزان مول برابر از آلکیل هالید و متیل ایمیدازولیوم استفاده شد. در این روش متیل ایمیدازولیوم قطره قطره در فواصل زمانی مساوی به آلکیل هالید که در حال بهم خوردن شدید بود اضافه شد و محلول نهایی در حال بهم خوردن شدید به مدت ۲۴ ساعت در دمای °C 50 رفلاکس شد (شکل۳-۱). در مرحله بعد محلول بدست آمده با دی اتیل اتر شستشو داده شد تا مواد آلی واکنشگر باقیمانده حذف شود. مرحله شستشو ۱۰ تا ۱۵ بار انجام شد. پس از هر بار افزودن دی اتیل اتر به مایع یونی و بهم زدن شدید آن، محلول در حال سکون قرار داده شد تا دو فاز مایع یونی و دی اتیل اتر از هم جدا شوند. سپس مایع یونی شسته شده به مدت ۲۴ ساعت در آون°C 50 گذاشته شد تا دی اتیل اتر آن کاملا تبخیر شود.
شکل ۳-۱- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید
۳-۳-۱-۲- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات
در این مرحله میزان مول مساوی از نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات در مقداری آب حل شد و سپس محلول نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات به کمک بورت قطره قطره به محلول آبی مایع یونی دارای آنیون برومید در حال بهم خوردن شدید اضافه گردید. سپس به مدت ۲۴ ساعت در دمای اتاق محلول روی استیرر بهم خورد تا واکنش جایگزینی آنیون به خوبی انجام شود. در مرحله بعد شستشوی مایع یونی جدید با آب جهت جداسازی آنیون برومید انجام شد و تست برم دار بودن به کمک نیترات نقره نبود یون برمید را در مایع یونی PF₆^- دار تایید کرد. سپس مایع یونی PF₆^- دار بدست آمده به مدت ۲۴ ساعت برای حذف آب موجود در محیط در آون خلاء در دمای °C 70 قرار داده شد. مایع یونی ساخته شده در ظرف درب دار نگهداری شد.
۳-۳-۲- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب
۳-۳-۲-۱- محیط کشت باکتری E. coli
در این پژوهش از محیط کشت Luria Bertani (LB) برای رشد سویه­های اشرشیا­کلی به صورت مایع و جامد (حاوی آگار) استفاده گردید. همچنین در محیط کشت سوش­های حامل ساختار پلاسمید از آنتی­بیوتیک آمپی­سیلین با غلظت نهایی µg/ml 100 استفاده شد. جدول ۳-۱ نشان دهنده ترکیبات محیط کشت Luria Bertani است. شایان ذکر است که آنتی بیوتیک پس از استریل شدن محیط کشت توسط اتوکلاو و رسیدن دمای محیط کشت به حدود C° ۵۰ اضافه می­گردد.
جدول ۳-۱- محیط کشت Luria Bertani

۳-۳-۲-۲- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli
۳-۳-۲-۲-۱- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی:
به منظور تهیه سلول­های مستعد برای عمل ترانسفورماسیون (انتقال پلاسمید به داخل سلول)، ابتدا یک کشت خطی از سلول­های ذخیره شده مورد نظر در ازت مایع بر روی پلیت LB تهیه و یک شب در گرمخانه Cº ۳۷ قرار داده می­ شود. سپس یک کلنی از روی پلیت برداشته و در شرایط استریل به ۲۵ میلی لیتر محیط کشت مایع LB افزوده و به مدت ۴ الی ۶ ساعت در دمای cº۳۷ با حرکت دورانی rpm180رشد داده می­ شود تا تراکم سلول­ها در محیط کشت به جذبی ما بین ۴/۰ تا ۶/۰ در طول موج ۶۰۰ نانومتر برسد. سلول­ها را در دمای ºC 4 به مدت ۱۰ دقیقه در g4000 سانتریفوژ کرده و آن­ها را در۵/۲ میلی­لیتر محیط خاص مناسب برای تهیه ی این نوع سلول­ها به نام محیط TSB که طبق جدول۳-۲ تهیه گردید، به صورت معلق در می­آوریم. لازم به ذکر است که در این حالت غلظت سلولی به میزان ۱۰ برابر افزایش داده می­ شود. سپس سلول­های معلق شده را به مدت ۱۰ الی ۶۰ دقیقه (بسته به نوع سلول E.coli مورد استفاده) برروی یخ قرار می­دهیم. محصول سلولی حاصل را در مقادیر ۲۰۰-۱۰۰ میکرولیتری در لوله­های اپندروف استریل تقسیم کرده و بلافاصله در ازت مایع قرار می­دهیم. این سلول­ها را می­توان در فریزر cº۸۰- نگهداری کرد و به عنوان سلول مستعد به مدت حداقل شش الی دوازده ماه مورد استفاده قرار داد. لازم به ذکر است که از هر لوله تنها یک بار می­توان به عنوان سلول مستعد استفاده کرد.
۳-۳-۲-۲-۲- انتقال پلاسمید به سلول مستعد :