کاغذ صافی واتمن شماره ۱ مدل (MACHERY-NAGEL)
قیف
بالن ژوژه جهت ساختن استاندارد ها
میکرو پیپت^[۴۸] ۵ ، ۱۰، ۵۰، ۱۰۰ میلی لیتر جهت تزریق نمونه های هضم شده به دستگاه و ساخت محلول های استادارد
سر ^[۴۹]Sampler
میکروتیوپ^[۵۰] جهت نگهداری محلول های استاندارد
لوله های ^[۵۱]PTFE جهت قرار دادن نمونه ها بر روی Hot plate
۲-۲-۳- شناسایی مرجان های سخت
شناسایی مرجان های سخت براساس ساختار کربنات کلسیمی آنها صورت می پذیرد زیرا که هر گونه، ساختار متفاوتی دارد (Veron, 2000). علاوه بر ساختار ظاهری هر مرجان که در شناسایی آن به کار می رود ، ساختارهای میکروسکوپی هر کورالیت نیز کمک شایانی در شناسایی می نماید.
‏بدین منظور، پس از عکس برداری از کلنی مرجانی مورد نظر درون آب و همچنین عکس برداری پس از نمونه برداری در آزمایشگاه، نمونه ها توسط محلول سفیدکننده رنگ زدایی گشته سپس از اسکلت سفید مرجانی عکس های سیاه و سفید و رنگی با نمای نزدیک توسط دوربین عکاسی با لنز ماکرو و همپنین استریومیکروسکوپ دوربین دار تهیه گردیده و پولیپ های مرجانی در هر گونه از نظر پولیپ و نحوه استقرار، شکل و تعداد تیغه های عرضی (septa) و وجود لب و تاج پالی فرم(palliform crown)‏ مورد بررسی قرار گرفته و توسط کلید های شناسایی موجود، مشاوره با کارشناسان داخل و خاج از کشور صورت گرفت (۲۰۰۰‏Coles, 1995., Carpenter et al., 1997 and Veron, ‏).
۲-۲-۴- آماده سازی نمونه ها
پس از شناسایی مرجان ها، جهت جداسازی اولیه بافت نرم و زوگزانتله از بافت اسکلتی مرجان ها توسط دستگاه Air Brush در آزمایشگاه مرکز ملی اقیانوس شناسی صورت پذیرفت (Shen and Boyle, 1988). (شکل۲-۳). پس از انجام این مرحله برای اطمینان از جداسازی بافت نرم و زوگزانتله از بافت اسکلتی مرجان، مرجان ها را در دو بازه زمانی ۳۰ دقیقه ای در دمای اتاق درون بشری حاوی آب دیونیزه در دستگاه اُلتراسونیک^[۵۲] قرار می دهیم. از هیچ گونه اسیدی در این مرحله استفاده نمی کنیم به این دلیل که اسید باعث هضم فلزات می شود. بعد از این مرحله با جدا کردن اسکلت مرجان از محلول محتوی بافت نرم و زوگزانتله و سپس شستشو با آب دیونیزه، اسکلت حجیم مرجان ها را توسط چکش عایق دار کوبیده تا به اندازه های کوچتر تبدیل شوند. در مرحله بعدی تمامی نمونه ها را به روش Freez Dry به مدت ۴۸ ساعت خشک کرده (جهت اطمینان از خشک
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

شکل ۲-۳: مراحل آماده سازی نمونه ها در آزمایشگاه مرکز ملی اقیانوس شناسی
شدن کامل نمونه ها آنها را قبل و بعد از Freez Dry توسط ترازوی دیجیتالی با دقت ۰۰۱/۰ مدل Sartoirus- TE313J توزین می نماییم و از اختلاف مقدارآنها به صحت عمل خود پی می بریم)؛ پس از خشک شدن هر دو نمونه مرجان و رسوب، نمونه ها توسط هاون کوبیده شدند سپس جهت همگن سازی Blend شدند (با دستگاه Blender کاملا یکنواخت پودر شدند). سپس نمونه های رسوب با عبور از الک با دهانه ورودی ۲۵۰ میکرومتر و عدد ۶۰ mesh الک شدند و پس از توزین در قوطی هایی برچسب دار قرارگرفته و در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد تا زمان انجام عملیات هضم نگهداری شدند. نمونه های مرجان نیز پس از کوبیده شدن در هاون و blend شدن، توزین گشته و در ZipBag یا قوطی نمونه قرار گرفت و برچسب زده شدند.
پس از این مرحله از مقادیر موجود نمونه های خشک و الک شده( ۱۰- ۱۵ گرم نمونه خشک شده همگن شده و الک شده) به مقدار لازم جهت انجام مرحله هضم یا آنالیز توزین گردید.
۲-۲-۴-۱- شستن لوازم آزمایشگاهی
در شستن لوازم آزمایشگاهی، شستشوی معمولی قابل قبول نمی باشد چون این عمل به شدت بر کاربرد این ظروف در عمل تجزیه تاثیرگذار است. روش زیر جهت شستشوی لوازم آزمایشگاهی مناسب است، این روش شامل یک مرحله کاهش آلودگی و سپس شستن با اسید کلریدریک و اسید نیتریک است.
مرحلۀ اول: شستن توسط یک شوینده است که با جنس وسیلۀ مورد استفاده سازگاری دارد سپس از آب معمولی به مقدار زیاد جهت شستن با شوینده و ۳ بار آب مقطر و تست بلانک استفاده می شود.
مرحلۀ دوم: استفاده از اسید کلریدریک است که لوازم به مدت یک هفته در دمای اتاق در آن قرار می گیرند و یا می توان ۳ روز در دمای ۵۰ درجۀ سانتیگراد قرار داده و بعد از این مدت باید با آب مقطر کاملاً شسته شوند .
مرحلۀ سوم: در این مرحله از اسید نیتریک استفاده می کنیم که لوازم به مدت یک هفته در دمای اتاق در آن قرار می گیرند و سپس با آب مقطر شستشو می دهیم.
سپس لوازم را با جریان هوای خشک و ملایم هود خشک می کنیم و آنها را در یک کیسه پلی اتیلنی جهت استفاده نگهداری می کنیم.
ظروف نمونه و بطور مثال بطری ها و بالن ها باید در اسید کلریدریک و یا اسید نیتریک ۱/۰ % فوق العاده خالص نگهداری شوند (MOOPAM,1999 ).
کلیه وسایل، امکانات نمونه برداری، آماده سازی و سنجش نمونه ها توسط روش های فوق شستشو داده شدند.
۲-۲-۵- هضم نمونه ها
۲-۲-۵-۱- هضم نمونه های مرجان
هضم نمونه های مرجانی توسط ترکیب غلیظی از اسید نیتریک و اسید پرکلریدریک غلیظ در آزمایشگاه دانشگاه تربیت مدرس تهران انجام شد. در روش درحدود یک گرم توزین شده از نمونه خشک شده و پودر شده مرجان، درون لوله های شیشه ای PTFE (Digestion tube) میریزیم، و سپس ترکیب اسید نیتریک و اسید پرکلریدریک پرکلریدریک با نسبت حجمی ۴ به ۲ به لوله های شیشه ای PTFE تا حجم cc 25 اضافه کرده به مدت ۱ ساعت در دمای ۹۵ درجه سانتی گراد روی دستگاه Hot plate قرار داده تا تقریباً خشک شود؛ سپس اجازه می دهیم که ظروف و نمونه های درحال هضم خنک شده و با اضافه کردن cc10 اسید نیتریک غلیظ دوباره به مدت ۲ ساعت در دمای ۱۱۵ درجه سانتی گراد روی دستگاه Hot plate قرار داده تا کاملاً خشک گردد. بعد از سپری شدن این مدت زمان نمونه های درحال هضم تا حجم cc25 با آب دوبار تقطیرشده شسته، خنک می گردند و پس از فیلتر شدن محلول نهایی درون ظروف پلی اتیلنی cc50 نگهداری می شوند. برای انجام این مرحله نمونه آماده شده را به ظرف پلی اتیلنیcc 50 که روی دهانه آن قیف قرار داده شده و روی قیف کاغذ صافی واتمن شماره ۱ گذاشته شده است منتقل می کنیم در نهایت حجم نمونه ها cc25 درنظرگرفته می شود(Denton and Burton Jones, 1986) . در جدول۲-۲ مروری بر تکنیک های مختلف سنجش و هضم بکار برده شده جهت اندازه گیری فلزات سنگین در گونه های مختلف مرجان ها آورده شده است.
۲-۲-۵-۲- هضم نمونه های رسوب
برای هضم رسوبات در مقدار لازم از نمونه خشک شده و پودر شده (۱ گرم) را برداشته درون لوله های شیشه ای PTFE Digestion tube)) میریزیم، سپس cc 10 اسید نیتریک غلیظ (۶۹%) به اضافه اسید پرکلریدریک با نسبت حجمی ۴ به ۱ درون لوله های PTFEاضافه کرده به مدت ۱ ساعت در دمای ۴۰ درجه سانتی گراد روی دستگاه Hot plate قرار داده، بعد از سپری شدن این مدت زمان مجددا به مدت ۳ ساعت در دمای ۱۴۰ درجه سانتی گراد روی دستگاه Hot plate قرار داده می شود. سپس به مدت ۱ ساعت اجازه می دهیم که نمونه خنک شود. بعد از سپری شدن این مدت زمان نمونه های درحال هضم تا حجم cc25 با آب دوبار تقطیرشده شسته، پس از فیلر شدن محلول نهایی درون ظروف پلی اتیلنی cc50 نگهداری می شوند. برای انجام این مرحله نمونه آماده شده را به ظرف پلی اتیلنیcc 50 که روی دهانه آن قیف قرار داده شده و روی قیف کاغذ صافی واتمن شماره ۱ گذاشته شده است منتقل می کنیم. در نهایت حجم نمونه هاcc 25 درنظرگرفته می شود (Yap et al ,۲۰۰۲). (شکل۲-۴).
۲-۲-۶- روش های اندازه گیری فلزات سنگین
به طور کلی روش های متنوعی برای سنجش میزان فلزات سنگین وجود دارد از جمله:
روش دی تیزون ^[۵۳]
روش اسپکتوفتومتری جذب اتمی ^[۵۴](AAS)
روش الکترو شیمیایی برهنه سازی آندی ^[۵۵](ASV)
روش اسپکتروسکوپی نشری^[۵۶]
روش فلورسانس اشعه ایکس ^[۵۷]
روش فعال سازی نوترونی^[۵۸]
۲-۲-۶-۱- انتخاب روش
در حال حاضر عمده ترین روش اندازه گیری نیکل در بافت های بیولوژیک بهره گیری از روش اسپکتروفتومتری جذب اتمی می باشد. علاوه بر راحت بودن روش سنجش و کار با دستگاه باید گفت حساسیت و دقت بالای دستگاه در اندازه گیری مقادیر جزئی عناصر ثابت شده است. روش جذب اتمی در اواسط سال ۱۹۵۰ توسط آلن والش معرفی گردید. هر چند که پایه و اصول اساس طیف سنجی جذب اتمی در سال های قبل از ۱۸۶۰ توسط کیروشف بنا نهاده شده بود.به طور کلی روش طیف سنجی جذب اتمی در مفهوم شیمی تجزیه به عنوان روشی جهت تعیین مقدار غلظت یک عنصر در نمونه با اندازه گیری مقدار جذب تشعشعات در بخار اتمی تولید شده از نمونه در طول موجی که انحصاراً به عنصر تحت اندازه گیری تعلق دارد توصیف و تعریف می شود(Al- Saleh and Shinwari, 2002;Ganjavi et al., 2010, Uluozlu et al., 2007;).
روش طیف سنجی جذب اتمی برای تعیین غلظت عناصر فلزی در مقادیر بسیار کم شناخته شده است و روش سریع، حساس و اختصاصی برای فلزات می باشد. همان طور که گفته شد اساس این روش اندازه گیری مقدار جذب بخار اتمی فلزی می باشد. به این صورت که نمونه محلول را داخل یک شعله^[۵۹] یا کوره گرافیتی^[۶۰] با درجه حرارت بالا عبور داده به طوری که اتم هایی که در سطوح پائین تر از انرژی قرار دارند تبدیل به ذرات ریز (Atomized) شده و از مسیر نوری که توسط لامپ کاتدی تو خالی (Hollow cathode Lamp) که نور مخصوص یک فلز ویژه را از خود منتشر می نماید عبور می کند. اگر در نمونه فلز مورد نظر وجود داشته باشد بر حسب غلظت آن اتم های فلز فوق مقداری از نور منتشر شده را جذب نموده و میزان جذب که متناسب با غلظت عنصر مورد نظر است به وسیله قسمت شناساگر دستگاه (Detector) اندازه گیری و در مقایسه با منحنی استاندارد غلظت فلز مورد نظر تعیین می گردد. در تعیین غلظت عناصر فلزی کمیاب در نمونه های بیولوژی لازم است قبل از سنجش عنصر فلزی با بهره گرفتن از محلول های استاندارد فلز مورد نظر، منحنی کالیبراسیون رسم تا با بهره گرفتن از منحنی کالیبراسیون غلظت عناصر فلزی مورد نظر در نمونه مورد آزمایش با توجه به میزان جذب نور توسط آن محاسبه گردد.
برای هر نمونه آزمایش سه بار تکرار و نهایتا میانگین سه بار سنجش به عنوان مقدار غلظت واقعی فلز مورد نظر ثبت گردید. (Moopam, 1999).
۲-۲-۶-۲- محدودیت ها و مشکلات کار با دستگاه طیف سنجی جذب اتمی
عوامل متعددی وجود دارند که باعث محدود شدن حساسیت، دقت و صحت روش های تجزیه ای می گردند. در دستگاه طیف سنجی جذب اتمی می توان موارد زیر را به عنوان محدودیت های کار با دستگاه نام برد:
محدودیت های طیفی^[۶۱]
محدودیت های یونیزاسیون^[۶۲]
محدودیت های حلال و مواد شیمیایی^[۶۳]
مشکلات تهیه بافت
با توجه به این که طیف جذبی برای هر عنصر اختصاصی می باشد و این عامل به عنوان یکی از مزایای دستگاه به شمار می رود اما متاسفانه به دلیل فعل و انفعالاتی که در هنگام قرار گرفتن نمونه در شعله، کوره و یا سایر مراحل و بخش های انجام گرفته در دستگاه صورت می گیرد مشکلاتی ایجاد می شود و یا حتی ممکن است عناصر موجود در محلول چنین مزاحمت هایی را ایجاد کنند که به عنوان مشکلات کار با دستگاه طیف سنجی جذب اتمی به شمار می رود ازجمله :
خطاهای احتمالی در تهیه استاندارها
کاهش فشار گاز کپسول های هوا و استیلن
وجود ناخالصی در گازهای مورد استفاده